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光片成像-Lightsheet熒光顯微成像
Lightsheet熒光顯微技術(shù)
Lightsheet的目標(biāo)與共聚焦一樣,也是進(jìn)行三維成像。與傳統(tǒng)上的激光掃描共聚焦/轉(zhuǎn)盤共聚焦、雙光子共聚焦相比,Lightsheet的優(yōu)勢在于很小的光漂白(因為激光掃描共聚焦/轉(zhuǎn)盤共聚焦都會掃到焦平面外的熒光探針)以及能夠觀察大到1cm的樣品(雙光子共聚焦僅有1mm左右)。而且由于可以直接采用高-分辨率的相機直接對一個焦平面同時成像,所以針對較大樣品的時候速度也比共聚焦的掃描要更快。Lightsheet技術(shù)可以實現(xiàn)超大樣品塊、快速掃描、深度成像、高-分辨率、3D動態(tài)圖像輸出,因而受到生命科學(xué)研究者,尤其是神經(jīng)發(fā)育顯微成像領(lǐng)域的研究者的歡迎。
Lightsheet技術(shù)用途
Lightsheet傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡和MRI,CT等成像之間的空隙;在遺傳、發(fā)育等研究中有著較好的應(yīng)用及前景。因為遺傳發(fā)育學(xué)研究者在選擇模式生物(如斑馬魚、果蠅、線蟲等)的時候,透明以利于觀察以及生命周期短是兩個著重考量的因素;透明對于Lightsheet的作用不言而喻,生命周期短的動植物一般也不會長得太大,所以這些模式生物都比較適合于Lightsheet的功能。
Lightsheet技術(shù)操作
Lightsheet(光片照明)顯微鏡使用一層光束從樣品側(cè)面激發(fā)熒光樣品,通過sCMOS相機來檢測成像,而入射照明光路和sCMOS接收熒光光路互相垂直。通過移動樣品使入射光面激發(fā)不同的平面,且激發(fā)光束從左右兩個方向入射到樣品上,光束的角度可以改變,這樣就可以很容易的得到整個組織的3D圖像,同時保證細(xì)胞水平的分辨率。由于樣品受激發(fā)的平面就是成像平面,所以可以將光漂白和光學(xué)損傷降低到較低。
Lightsheet技術(shù)對成像的要求
Lightsheet對于相機的主要要求是高速、高像素和高靈敏度。高速對應(yīng)了整套lightsheet所需要的時間分辨率;高像素則對應(yīng)的是樣品的尺寸,如果像素不夠會導(dǎo)致實際成像分辨率的下降;高靈敏度一個是為了減小曝光時間,另一個則是因為lightsheet所觀察的樣品偏厚,從樣品深處發(fā)出的熒光不可避免地會損失得比較厲害,高靈敏度有利于彌補這個情況。
Lightsheet技術(shù)成像產(chǎn)品
基于lightsheet技術(shù)對于成像設(shè)備分辨率、高速度、高靈敏度的基本要求,sCMOS和速度快一些的EMCCD相機能很好的勝任lightsheet成像的任務(wù)。
濱松公司的sCMOS相機Flash 4.0V3非常適合用于lightsheet成像,除此之外,濱松Flash 4.0另提供專門的Lightsheet讀出模式,更是市場上此項應(yīng)用中相機的。
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