生物膜污水處理設(shè)備,抗生素的濫用誘導(dǎo)和加速了抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的產(chǎn)生、傳播以及抗生素耐藥菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)形成的風(fēng)險(xiǎn), 并且ARGs的存在是細(xì)菌表現(xiàn)耐藥性的根本原因.ARGs作為一類(lèi)新型的環(huán)境污染物, 可通過(guò)質(zhì)粒、整合子以及轉(zhuǎn)座子等可在細(xì)菌同種屬菌株間和不同種屬的菌株之間發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移, 即使ARB死亡后, 攜帶ARGs的裸露DNA會(huì)在脫氧核苷酸酶的保護(hù)作用下*存在, 故ARGs在環(huán)境中的持久性殘留、傳播和擴(kuò)散比抗生素本身的危害還要大.目前, ARGs廣泛存在于不同的生態(tài)環(huán)境中, 如水環(huán)境、土壤和大氣, 其中作為水環(huán)境之一的污水廠被認(rèn)為是ARB和ARGs巨大的儲(chǔ)存地.以前針對(duì)ARGs的大多數(shù)研究主要集中在處理醫(yī)院和生活污水的城市污水廠上.然而, 迄今為止, 很少從醫(yī)藥化工廢水中檢測(cè)出ARB和ARGs.

   【江西科豐環(huán)保有限公司】本工廠主要生產(chǎn)MBR膜一體化污水處理成套設(shè)備，設(shè)備不產(chǎn)生污泥，不加藥，含膜反沖洗功能，永bu堵膜，一罐搞定。可委托加工/貼牌生產(chǎn)/安裝培訓(xùn)/免費(fèi)安裝調(diào)試/。合同承諾出水達(dá)*A排放標(biāo)準(zhǔn)，歡迎來(lái)工廠參觀考察。

　　 ARGs的檢測(cè)方法有可培方法和非培方法這兩大類(lèi).可培方法是通過(guò)培養(yǎng)基進(jìn)行微生物分離, 而后根據(jù)所分離微生物的耐藥性, 結(jié)合各種分子生物學(xué)方法或者對(duì)ARB進(jìn)行全基因組.但是由于自然環(huán)境中超過(guò)99%的微生物不能用傳統(tǒng)培養(yǎng)基方法進(jìn)行分離培養(yǎng), 故可培方法會(huì)遺漏大量ARB和ARGs.非培方法有PCR技術(shù)、qPCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)及宏基因組學(xué)技術(shù).無(wú)論是普通PCR技術(shù)還是qPCR技術(shù)只能局限于已知序列的單一耐藥基因檢測(cè), 并且只能對(duì)少數(shù)的ARGs進(jìn)行同時(shí)檢測(cè), 后還需要測(cè)序分析來(lái)進(jìn)一步確認(rèn).基因芯片技術(shù)雖然可以同時(shí)檢測(cè)出大量的ARGs, 但仍然要依賴于根據(jù)已知的耐藥基因序列設(shè)計(jì)出相應(yīng)的特異性強(qiáng)的探針, 并且其制作復(fù)雜, 費(fèi)用昂貴.而隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展, 宏基因組測(cè)序也越來(lái)越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷領(lǐng)域, 如感染類(lèi)型診斷、抗性基因的鑒定和傳染病的防控等.宏基因組技術(shù)通過(guò)高通量測(cè)序, 打破了傳統(tǒng)以培養(yǎng)為主的微生物研究方式, 直接提取遺傳物質(zhì)進(jìn)行遺傳操作, 不僅可以準(zhǔn)確獲得樣品微生物物種組成及豐度等信息, 進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)微生物功能, 還能分析微生物代謝網(wǎng)絡(luò)等多方面的信息, 并且可同時(shí)檢測(cè)大量的ARGs, 為尋找新基因、研究微生物多樣性提供了便利的工具. 

本研究借助宏基因組技術(shù)調(diào)查醫(yī)藥化工廢水廠中微生物群落組成, 并分析ARGs的多樣性及兩者之間的關(guān)系, 對(duì)掌握醫(yī)藥化工廢水中ARGs的污染現(xiàn)狀及控制其傳播, 保護(hù)微生態(tài)環(huán)境具有重要指導(dǎo)意義.

　　1 生物膜污水處理設(shè)備

　　1.1 樣品采集

　　本實(shí)驗(yàn)樣品取自江蘇某醫(yī)藥化工園區(qū)廢水處理廠, 該廢水廠主要功能是處理園區(qū)各醫(yī)藥化工企業(yè)排放的工業(yè)廢水, 納入廢水廠管網(wǎng)的廢水包括抗生素中間體廢水及農(nóng)藥中間體廢水等多種醫(yī)藥化工廢水.該廢水廠日處理量10萬(wàn)t, 收集的廢水中含β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)等幾大類(lèi)抗生素生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的高濃發(fā)酵廢水、化學(xué)合成廢水、其他制劑廢水及混合廢水(清洗水、冷卻循環(huán)水和生活污水等).廢水中含大量殘留的抗生素原材料、副反應(yīng)產(chǎn)物, 還含有機(jī)溶劑二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、和二氯甲烷等.廢水廠主要采用厭氧-缺氧-好氧(A2O)工藝.本實(shí)驗(yàn)樣品為活性污泥, 具體取自*混合式好氧生物處理池.取樣時(shí)先在池內(nèi)前中后三段各取約500 mL泥水混合樣品, 以保證樣品具有代表性, 現(xiàn)場(chǎng)混合均勻后, 用無(wú)菌50 mL離心管分裝后冰袋低溫冷藏, 當(dāng)日即進(jìn)行基因組DNA提取.

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 生物膜污水處理設(shè)備中微生物群落結(jié)構(gòu)

　　在該好氧活性污泥樣品中, 經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后, 共得到reads數(shù)目109 523 076條, 并由此組裝得到55 255個(gè)scaftig, 并預(yù)測(cè)了105 892個(gè)unigene.利用DIAMOND軟件將unigene在NCBI-NR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì), 后續(xù)用MEGAN軟件進(jìn)行注釋, 統(tǒng)計(jì)樣本在門(mén)水平(表 1)及屬水平(圖 1)上的*個(gè)豐度大的群落組成.

　　2.2 生物膜污水處理設(shè)備中微生物群落功能注釋

　　用DIAMOND軟件將unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 共注釋了54564個(gè)unigene, 結(jié)果如圖 2所示.從中可知, 該微生物菌群的功能通路相關(guān)的基因數(shù)量依次為：代謝>遺傳信息處理>環(huán)境信息處理>人類(lèi)疾病>細(xì)胞過(guò)程>生物系統(tǒng), 其中主要的功能通路是代謝相關(guān), 其次是遺傳信息處理, 第三是環(huán)境信息處理.屬于代謝類(lèi)別的功能分類(lèi)中豐度依次為：碳代謝>氨基酸代謝>能量代謝>核苷酸代謝>輔因子和維生素的代謝>異生素生物降解與新陳代謝>脂質(zhì)代謝>萜類(lèi)和聚酮化合物代謝>其他氨基酸代謝>其他次生代謝物生物合成>多糖生物合成與代謝, 其中碳代謝、氨基酸代謝和能量代謝的基因數(shù)量尤為豐富, 分別為7 788、6 155和5 067個(gè).屬于遺傳信息處理類(lèi)別的功能分類(lèi)豐度依次為：復(fù)制與修復(fù)>折疊、分類(lèi)與降解>翻譯>轉(zhuǎn)錄, 其中復(fù)制與修復(fù)是主要部分, 基因數(shù)量為2 535個(gè).該微生物菌群功能通路中還有一部分的環(huán)境信息處理類(lèi)別的功能, 其分類(lèi)類(lèi)別豐度依次為：膜轉(zhuǎn)運(yùn)>信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)>信號(hào)分子與相互作用, 其中主要的是膜轉(zhuǎn)運(yùn), 基因數(shù)據(jù)為2 678個(gè), 其他兩個(gè)類(lèi)別的基因合計(jì)100個(gè), 數(shù)目甚少.屬于人類(lèi)疾病類(lèi)別豐度依次為：傳染性疾病>神經(jīng)退行性疾病>內(nèi)分泌和代謝疾病>癌癥>物質(zhì)依賴>免疫疾病>心血管疾病, 其中細(xì)菌傳染性疾病相關(guān)的基因數(shù)目尤其突出, 為517個(gè), 是其他人類(lèi)疾病基因總數(shù)的約1.6倍.而在傳染病疾病中, 細(xì)菌感染性疾病相關(guān)的基因占據(jù)了大部分, 約80%.

　　在該廢水廠中細(xì)菌傳染疾病涉及到9類(lèi)(圖 3), 其豐度依次為軍團(tuán)桿菌病>結(jié)核病>沙門(mén)氏菌感染>幽門(mén)螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)>*感染>上皮細(xì)胞的細(xì)菌入侵>百日咳>致病性大腸桿菌感染>霍亂弧菌感染, 其中主要的傳染病為軍團(tuán)桿菌病, 其基因數(shù)目為136個(gè);其次是結(jié)核病, 基因數(shù)目為108個(gè);沙門(mén)氏菌感染和幽門(mén)螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo), 基因數(shù)目均在60個(gè)左右;其他疾病的基因數(shù)目在15個(gè)以下.

　　根據(jù)功能注釋結(jié)果, 該廢水廠菌群中主要的功能通路是代謝相關(guān), 并且還存在許多與人類(lèi)疾病相關(guān)的基因, 其中主要是細(xì)菌感染性疾病.到目前為止, 新出現(xiàn)的傳染病事件的發(fā)生率有所增加, 廢水廠等特殊環(huán)境可以作為許多病原體的天然宿主對(duì)人類(lèi)健康存在潛在威脅.

　　2.3 生物膜污水處理設(shè)備及耐藥機(jī)制

　　用BLAST軟件將unigene在抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)CARD中進(jìn)行比對(duì), 結(jié)果如圖 4所示.經(jīng)過(guò)氨基酸大于50%標(biāo)準(zhǔn)控制后, 共注釋到74類(lèi)抗生素功能基因, 涉及包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)、*類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、多肽類(lèi)、喹諾酮類(lèi)及磺胺類(lèi)等多種抗生素抗性基因.

ARGs中sav1866、dfrE和mfd是主要ARGs.sav1866基因?qū)儆诙嘀啬退幓? 其編碼的蛋白是ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 其耐藥機(jī)制屬于ABC外排泵.在細(xì)菌中, 許多ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都與抗生素耐受性有關(guān).sav1866被檢測(cè)為豐度大的ARGs, 推測(cè)這與該廢水廠處理多種抗生素中間體廢水及多種農(nóng)藥中間體廢水密切相關(guān).dfrE基因*被發(fā)現(xiàn)在糞腸球菌中, 其編碼的蛋白是一種耐*二氫*還原酶(dihydrofolate reductases, DHFRs), 該種DHFRs具有高的*抗性, 其耐藥機(jī)制是抗生素靶位點(diǎn)改變.mfd基因的產(chǎn)物Mfd是轉(zhuǎn)錄-修復(fù)偶聯(lián)因子蛋白, 屬于DNA移位酶, 也是DNA修復(fù)的必須因子, 其耐藥機(jī)制是抗生素靶位點(diǎn)保護(hù).Mfd主要功能是促進(jìn)DNA修復(fù), 但在某些情況下, 如在復(fù)制-轉(zhuǎn)錄沖突區(qū)域和在穩(wěn)定階段的突變中, Mfd反而增加了突變, 如Mfd促使空腸彎曲桿菌產(chǎn)生了對(duì)喹諾酮藥物的抗性.在新的研究結(jié)果中, Mfd被認(rèn)為是一種促進(jìn)突變的進(jìn)化因子, 加速了抗生素耐藥性的發(fā)展, 是不同類(lèi)群的細(xì)菌快速獲得各種抗生素耐藥性所必須的[35].由此推測(cè), mfd基因的大量存在及積累可能會(huì)促進(jìn)廢水廠中微生物產(chǎn)生更多抗生素抗性.

　統(tǒng)計(jì)這些ARGs的耐藥機(jī)制, 以調(diào)查該廢水廠的耐藥機(jī)制情況, 如圖 5中(a)所示.在該醫(yī)藥化工廢水好氧活性污泥處理系統(tǒng)中, 微生物存在耐藥的機(jī)制有5種, 分別是抗生素失活(8%)、抗生素靶位點(diǎn)改變(4%)、抗生素靶位點(diǎn)保護(hù)(7%)、抗生素靶位點(diǎn)替換(11%)和抗生素特異的外排泵(70%), 其中抗生素特異的外排泵是主要的耐藥機(jī)制, 占比50%以上.在所研究的菌群中的外排泵組成如圖 5(b)所以, 主要由ABC外排泵(18%)、MFS外排泵(10%)、RND外排泵(34%)和SMR外排泵(3%)組成, 其中RND外排泵是該微生物菌群抗生素外排泵耐藥機(jī)制的主要類(lèi)型, 其次是ABC外排泵.細(xì)菌細(xì)胞膜上的主動(dòng)外排泵可將抗菌藥物排至細(xì)菌外, 從而阻礙抗菌藥物與細(xì)菌內(nèi)的靶點(diǎn)結(jié)合, 引起耐藥.并且, 外排泵在細(xì)菌中廣泛存在, 在介導(dǎo)細(xì)菌多重耐藥中起著重要作用.本研究表明, *、四環(huán)素、磺胺類(lèi)、*類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素均能通過(guò)細(xì)菌的主動(dòng)外排機(jī)制而被排出細(xì)胞外.而該研究的醫(yī)藥化工污水系統(tǒng)所具有的外排泵中, RND外排泵是主要機(jī)制.RND外排泵的外排底物比較廣泛, 包括多種抗菌藥物、消毒劑和染料等, 由此可推測(cè)該菌群對(duì)多種抗生素具有抗性.結(jié)合圖 4, 屬于RND外排泵的ARGs有smeD、mdtB、mexJ、smeR、cmeB和mexQ等, 涉及氨基抗生素、四環(huán)素抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌素、氨基糖苷抗生素、三氯沙抗生素和*類(lèi)抗生素、*等ARGs;屬于ABC外排泵的ARGs有l(wèi)mrD、otrC、novA、macB和sav1866, 涉及林可酰胺類(lèi)抗生素、四環(huán)素類(lèi)抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的耐藥.

　　2.4 生物膜污水處理設(shè)備與微生物類(lèi)群的關(guān)聯(lián)

　　對(duì)廢水廠中ARGs與微生物類(lèi)群的共存模式進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析(圖 6), 結(jié)果顯示有44類(lèi)ARGs與污水廠中屬級(jí)的微生物分類(lèi)群高度相關(guān), 并且主要類(lèi)群的屬都是多重耐藥菌株, 同時(shí)攜帶多種ARGs, 涉及到4大類(lèi)ARGs耐藥機(jī)制.Hyphomicrobium屬和Thauera屬均可能攜帶有近20個(gè)ARGs, Paracoccus屬和Methyloversatilis屬可能攜帶有近10個(gè)ARGs.如Hyphomicrobium屬中可能攜帶的抗性基因有dfrA26、mdsB、qepA、tetT、mexQ、mexF、mexL、rosB、sul2、dfrE、mfd和bacA等;Thauera屬則可能攜帶有mdtD、bacA、mexJ、tet36、oprM、acrB和novA等.